ఫాస్ట్ కింగ్ వన్ స్టెప్ RT-PCR కిట్

A-1 RNA అధోకరణం చెందింది

—— కాలుష్యం లేకుండా అధిక నాణ్యత గల RNA ని శుద్ధి చేయండి. RNA క్షీణతను నివారించడానికి RNA సేకరించిన పదార్థం సాధ్యమైనంత తాజాగా ఉండాలి. RT ప్రతిచర్యకు ముందు డీనాచర్డ్ జెల్‌పై RNA సమగ్రతను విశ్లేషించండి. RNA వెలికితీసిన తరువాత, దానిని 100% ఫార్మామైడ్‌లో నిల్వ చేయాలి. RNase నిరోధకం ఉపయోగించినట్లయితే, తాపన ఉష్ణోగ్రత <45 ° C, మరియు pH 8.0 కంటే తక్కువగా ఉండాలి, లేకుంటే నిరోధకం అన్ని బంధిత RNase ని విడుదల చేస్తుంది. అంతేకాకుండా, N 0.8 mM DTT కలిగిన పరిష్కారాలలో RNase నిరోధకం జోడించబడాలి.

A-2 RNA రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రతిచర్యల నిరోధకాలను కలిగి ఉంది

——- రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఇన్హిబిటర్‌లలో SDS, EDTA, గ్లిసరాల్, సోడియం పైరోఫాస్ఫేట్, స్పెర్మిడిన్, ఫార్మామైడ్, గ్వానిడిన్ ఉప్పు మొదలైనవి ఉన్నాయి. నియంత్రణ RNA ని నమూనాతో కలపండి మరియు దిగుబడిని నియంత్రించే RNA ప్రతిచర్యతో సరిపోల్చండి. నిరోధకాలను తొలగించడానికి RNA అవపాతాన్ని 70% (v/v) ఇథనాల్‌తో కడగాలి.

A-3 cDNA యొక్క మొదటి స్ట్రాండ్‌ను సంశ్లేషణ చేయడానికి ఉపయోగించే ప్రైమర్‌ల యొక్క తగినంత ఎనియలింగ్

—— ప్రయోగంలో ఉపయోగించిన ప్రైమర్‌లకు ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత అనుకూలంగా ఉందని నిర్ణయించండి. యాదృచ్ఛిక హెక్సామర్‌ల కోసం, ప్రతిచర్య ఉష్ణోగ్రతను చేరుకోవడానికి ముందు 10 నిమిషాల పాటు 25 ° C ఉష్ణోగ్రతని ఉంచాలని సిఫార్సు చేయబడింది. జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌ల (GSP) కోసం, ఇతర GSP ని ప్రయత్నించండి లేదా ఒలిగో (dT) లేదా యాదృచ్ఛిక హెక్సామర్‌కి మారండి.

A-4 ప్రారంభ RNA యొక్క చిన్న మొత్తం

—— RNA మొత్తాన్ని పెంచండి. 50 ng కంటే తక్కువ RNA నమూనాల కోసం, 0.1 μg నుండి 0.5 μg ఎసిటైల్ BSA మొదటి స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణలో ఉపయోగించవచ్చు

A-5 విశ్లేషించబడిన కణజాలాలలో లక్ష్య క్రమం వ్యక్తీకరించబడదు.

—— ఇతర కణజాలాలను ప్రయత్నించండి.

A-6 PCR ప్రతిచర్య విఫలమైంది

—— రెండు-దశల RT-PCR కొరకు, PCR దశలో cDNA టెంప్లేట్ ప్రతిచర్య వాల్యూమ్‌లో 1/5 మించకూడదు.

A-1 ప్రైమర్‌లు మరియు టెంప్లేట్‌ల నాన్-స్పెసిఫిక్ ఎనియలింగ్

—— ప్రైమర్‌ల 3'-ఎండ్‌లో 2-3 dG లేదా dC ఉండకూడదు. యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లు లేదా ఒలిగో (డిటి) కి బదులుగా మొదటి స్ట్రాండ్ సంశ్లేషణలో జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించండి. మొదటి కొన్ని చక్రాలలో అధిక ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను ఉపయోగించండి, ఆపై తక్కువ ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను ఉపయోగించండి. ప్రతిచర్య యొక్క విశిష్టతను మెరుగుపరచడానికి PCR కోసం హాట్-స్టార్ట్ టాక్ DNA పాలిమరేస్‌ని ఉపయోగించండి.

A-2 జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌ల యొక్క పేద డిజైన్

—— యాంప్లిఫికేషన్ ప్రైమర్ డిజైన్ కోసం అదే సూత్రాలను అనుసరించండి.

A-3 RNA జన్యుసంబంధమైన DNA తో కలుషితమైంది

—— PCR- గ్రేడ్ DNase I తో చికిత్స RNA. DNA కలుషితాన్ని గుర్తించడానికి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ లేకుండా నియంత్రణ ప్రతిచర్యను సెటప్ చేయండి.

A-4 ప్రైమర్ డైమర్ ఏర్పాటు

—— 3 'ముగింపులో కాంప్లిమెంటరీ సీక్వెన్స్‌లు లేకుండా ప్రైమర్‌లను డిజైన్ చేయండి.

A-5 చాలా ఎక్కువ Mg²⁺ ఏకాగ్రత

—— Mg ని ఆప్టిమైజ్ చేయండి²⁺ ప్రతి టెంప్లేట్ మరియు ప్రైమర్ కలయిక కోసం ఏకాగ్రత

A-6 విదేశీ DNA తో కలుషితమైంది

——ఏరోసోల్ నిరోధక చిట్కాలు మరియు UDG ఎంజైమ్‌లను ఉపయోగించండి.

A-1 మొదటి స్ట్రాండ్ ఉత్పత్తి యొక్క కంటెంట్ చాలా ఎక్కువగా ఉంది

—— సంప్రదాయ PCR ప్రతిచర్య దశలో మొదటి స్ట్రాండ్ ఉత్పత్తి మొత్తాన్ని తగ్గించండి.

PCR ప్రతిచర్యలో A-2 చాలా అధిక ప్రైమర్ మొత్తం

—— ప్రైమర్ ఇన్‌పుట్‌ను తగ్గించండి.

A-3 చాలా చక్రాలు

—— PCR ప్రతిచర్య పరిస్థితులను ఆప్టిమైజ్ చేయండి మరియు PCR సైకిల్ సంఖ్యను తగ్గించండి.

A-4 చాలా తక్కువ ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత

—— నిర్ధిష్ట ప్రారంభం మరియు పొడిగింపును నిరోధించడానికి ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను పెంచండి.

A-5 DNA యొక్క DNase క్షీణత ద్వారా ఉత్పన్నమయ్యే ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ శకలాల నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ -— DNA కలుషితాన్ని నివారించడానికి అధిక-నాణ్యత RNA ను సంగ్రహించండి.

RT-PCR అనేది RNA ని cDNA లోకి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ చేయడం, ఆపై రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్స్డ్ cDNA ని PCR రియాక్షన్ కోసం టెంప్లేట్‌గా టార్గెట్ ఫ్రాగ్‌మెంట్‌ను విస్తరించడం. ప్రయోగం యొక్క నిర్దిష్ట పరిస్థితులకు అనుగుణంగా యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లు, ఒలిగో డిటి మరియు జన్యు నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లను ఎంచుకోండి. హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణం లేకుండా పైన పేర్కొన్న అన్ని ప్రైమర్‌లను షార్ట్ యూకారియోటిక్ సెల్ mRNA కోసం ఉపయోగించవచ్చు.

యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్: హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణంతో పొడవైన RNA, అలాగే rRNA, mRNA, tRNA వంటి అన్ని రకాల RNA లకు అనుకూలం. అవి ప్రధానంగా సింగిల్ టెంప్లేట్ యొక్క RT-PCR ప్రతిచర్యకు ఉపయోగిస్తారు.

ఒలిగో డిటి: పాలీఏ టెయిలింగ్‌తో ఆర్‌ఎన్‌ఏకు అనుకూలంగా ఉంటుంది (ప్రొకార్యోటిక్ ఆర్‌ఎన్‌ఏ, యూకారియోటిక్ ఒలిగో డిటిఆర్‌ఆర్‌ఎన్‌ఎ మరియు టిఆర్‌ఎన్‌ఎలకు పాలీఏ తోకలు లేవు). ఒలిగో డిటి పాలీఏ టెయిల్‌కి కట్టుబడి ఉన్నందున, ఆర్‌ఎన్‌ఏ నమూనాల నాణ్యత ఎక్కువగా ఉండాల్సిన అవసరం ఉంది, మరియు చిన్న మొత్తంలో అధోకరణం కూడా పూర్తి-నిడివి సిడిఎన్‌ఎ సంశ్లేషణ మొత్తాన్ని బాగా తగ్గిస్తుంది.

జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్: టెంప్లేట్ సీక్వెన్స్‌కు కాంప్లిమెంటరీ, టార్గెట్ సీక్వెన్స్ తెలిసిన పరిస్థితులకు అనుకూలం.

రెండు మార్గాలు ఉన్నాయి:

1. ఇంటర్నల్ రిఫరెన్స్ పద్ధతి: సిద్ధాంతంలో, సిడిఎన్ఎ అనేది వివిధ పొడవు గల డిఎన్ఎ శకలాలు, కాబట్టి ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ఫలితం స్మెర్. RNA సమృద్ధి తక్కువగా ఉంటే, ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌లో ఏ ఉత్పత్తి కనిపించదు, కానీ దీని అర్థం PCR ద్వారా ఏ ఉత్పత్తి విస్తరించబడదు. సాధారణంగా, అంతర్గత సూచన cDNA ని గుర్తించడానికి ఉపయోగించవచ్చు. అంతర్గత సూచన ఫలితాలు కలిగి ఉంటే, cDNA యొక్క నాణ్యత ప్రాథమికంగా హామీ ఇవ్వబడుతుంది (కొన్ని సందర్భాల్లో, లక్ష్య జన్యు భాగం చాలా పొడవుగా ఉంటే, మినహాయింపులు ఉండవచ్చు).

2. ఈ టెంప్లేట్ ద్వారా విస్తరించిన తెలిసిన జన్యువు ఉంటే, దానిని ఈ జన్యువు యొక్క ప్రైమర్‌ల ద్వారా ధృవీకరించవచ్చు. అంతర్గత సూచన యొక్క విస్తరణ తప్పనిసరిగా cDNA తో సమస్య లేదని అర్థం కాదు. CDNA లో అంతర్గత సూచన అధిక సమృద్ధిని కలిగి ఉన్నందున, దానిని విస్తరించడం సులభం. వివిధ కారణాల వల్ల సిడిఎన్ఎ పాక్షికంగా క్షీణించినట్లయితే, సంభావ్యత దృక్కోణంలో, తక్కువ సమృద్ధి లక్ష్య జన్యువుల పిసిఆర్ ఫలితాలు బాగా ప్రభావితమవుతాయి. అంతర్గత సూచన ఇప్పటికీ సమృద్ధిగా ఉన్నప్పటికీ, విస్తరణ బహుశా ప్రభావితం కాదు.

RNA యొక్క పాక్షిక క్షీణత. RNA యొక్క సమగ్రతను మరియు శుద్ధిని గుర్తించండి

విభిన్న జాతుల RNA విషయాలు భిన్నంగా ఉండవచ్చు, కానీ సాధారణంగా, సేకరించిన మొత్తం RNA జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌లో రెండు స్పష్టమైన 28S మరియు 18S బ్యాండ్‌లను కలిగి ఉండాలి మరియు మునుపటి బ్యాండ్ యొక్క ప్రకాశం తరువాతి కంటే రెండు రెట్లు ఎక్కువగా ఉండాలి. 5S బ్యాండ్ RNA క్షీణించిందని సూచిస్తుంది మరియు దాని ప్రకాశం అధోకరణ స్థాయికి అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది. అంతర్గత సూచన యొక్క విజయవంతమైన విస్తరణ RNA తో సమస్య లేదని అర్థం కాదు, ఎందుకంటే అంతర్గత సూచన అధిక సమృద్ధిగా ఉంటుంది, అధోకరణం తీవ్రంగా లేనంత కాలం RNA విస్తరించబడుతుంది. OD₂₆₀/OD₂₈₀స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ ద్వారా కొలిచిన స్వచ్ఛమైన RNA నిష్పత్తి 1.9 మరియు 2.1 మధ్య ఉండాలి. RNA లో కొద్ది మొత్తంలో ప్రోటీన్ అశుద్ధత నిష్పత్తిని తగ్గిస్తుంది. విలువ చాలా తక్కువగా లేనంత వరకు, RT ప్రభావితం కాదు. RT కి అత్యంత ముఖ్యమైనది RNA సమగ్రత.

అంతర్గత రిఫరెన్స్ జన్యువు యొక్క పొడిగింపు RT విజయవంతమైందని మాత్రమే సూచిస్తుంది, అయితే ఇది తప్పనిసరిగా cDNA స్ట్రాండ్ నాణ్యతకు సంబంధించినది కాదు. అంతర్గత రిఫరెన్స్ శకలాలు సాధారణంగా పరిమాణంలో చిన్నవి మరియు వ్యక్తీకరణలో ఎక్కువగా ఉంటాయి కాబట్టి, అవి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌లో విజయవంతం కావడం సులభం. ఏదేమైనా, లక్ష్య జన్యువు యొక్క పరిమాణం మరియు వ్యక్తీకరణ జన్యువు నుండి జన్యువు వరకు మారుతుంది. ముఖ్యంగా 2 kb కంటే ఎక్కువ లక్ష్య శకలాలు కోసం అంతర్గత సూచన ద్వారా మాత్రమే cDNA నాణ్యతను అంచనా వేయలేము.

కొన్ని నమూనాలు సంక్లిష్ట ద్వితీయ నిర్మాణాలను కలిగి ఉంటాయి లేదా గొప్ప GC కంటెంట్ కలిగి ఉంటాయి లేదా తక్కువ సమృద్ధితో విలువైనవి. ఈ సందర్భాలలో, టార్గెట్ శకలం పరిమాణం మరియు నమూనా ప్రకారం తగిన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ను ఎంచుకోవాలి. అధిక GC కంటెంట్ మరియు సంక్లిష్ట ద్వితీయ నిర్మాణంతో RNA టెంప్లేట్‌ల కోసం, తక్కువ ఉష్ణోగ్రత వద్ద లేదా సాధారణ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌తో ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని తెరవడం కష్టం. ఈ టెంప్లేట్‌ల కోసం, క్వాంట్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ను ఎంచుకోవచ్చు, ఎందుకంటే దాని రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ పనితీరు స్పష్టంగా M-MLV సిరీస్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేస్ కంటే మెరుగ్గా ఉంటుంది, ఇది వివిధ RNA టెంప్లేట్‌లను సమర్ధవంతంగా రివర్స్ చేయగలదు మరియు RNA ని cdNA మొదటి స్ట్రాండ్‌లోకి గరిష్టంగా ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ చేస్తుంది. సాధారణ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ కిట్‌ను ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు, 20 μl సిస్టమ్ మొత్తం RNA యొక్క 1 μg ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను మాత్రమే సమర్థవంతంగా రివర్స్ చేయగలదు. దయచేసి కిట్ యొక్క గరిష్ట RT సామర్థ్యంపై శ్రద్ధ వహించండి. టెంప్లేట్ అధికంగా చేర్చబడితే, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ అధిక సమృద్ధితో RNA కి అనుకూలంగా ఉంటుంది. అందువల్ల, సిస్టమ్ యొక్క గరిష్ట సామర్థ్యాన్ని మించకుండా ఉండటం మంచిది.

A-1 RNA తీవ్రంగా అధోకరణం చెందిందో మరియు RT విజయవంతమైందో నిర్ణయించండి

సాధారణంగా, అంతర్గత సూచన విస్తరణ వైఫల్యానికి కారణం తరచుగా తీవ్రమైన RNA క్షీణత వలన కలుగుతుంది. మరొక కారణం రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ వైఫల్యం. CDNA సింగిల్ స్ట్రాండ్ యొక్క నాణ్యతను నిర్ధారించడానికి ఇంటర్నల్ రిఫరెన్స్ ఒక స్టాండర్డ్‌గా ఉపయోగించబడదు, అయితే RNA నాణ్యత సమస్య లేనట్లయితే రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ విజయవంతమైందో లేదో నిర్ధారించడానికి దీనిని స్టాండర్డ్‌గా ఉపయోగించవచ్చు. రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రక్రియలో అత్యంత ముఖ్యమైన విషయం ఏమిటంటే ప్రతిచర్య సామర్థ్యాన్ని మెరుగుపరచడానికి స్థిరమైన ఉష్ణోగ్రత మరియు స్థిరమైన ప్రతిచర్య వ్యవస్థను నిర్వహించడం.

A-2 అంతర్గత రిఫరెన్స్ జన్యువులను విస్తరించడానికి ప్రైమర్‌లు నమ్మదగినవి కావా అని మరియు PCR లో ఉపయోగించే కారకాలతో ఏవైనా సమస్యలు ఉన్నాయో లేదో నిర్ణయించండి.

సాపేక్ష పరిమాణీకరణ కోసం, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌కు ముందు RNA తప్పనిసరిగా లెక్కించబడాలి, ఇది అనేక రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కిట్‌లలో కూడా అవసరం, ఉదాహరణకు, RNA ఇన్‌పుట్‌ను 1 .g గా లెక్కించండి. RNA, ఒలిగో dT, ఎంజైమ్, dNTP మరియు కొంచెం DNA అవశేషాలతో సహా రివర్స్ లిప్యంతరీకరించబడిన cDNA మిశ్రమ పరిష్కారం కనుక, విచలనం ఏర్పడుతుంది, కాబట్టి cDNA ని ఖచ్చితంగా లెక్కించడం అసాధ్యం. అందువల్ల, ఆర్‌ఎన్‌ఏ క్వాంటిఫికేషన్ అవసరం. రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ సామర్థ్యాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకుంటే వివిధ నమూనాలలో, పొందిన సిడిఎన్ఎ మొత్తం ఒకే విధంగా ఉండాలి, మరియు పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ మొత్తం RNA యొక్క అదే మొత్తంలో వివిధ జన్యువుల వ్యక్తీకరణ స్థాయిల పోలికను చూపుతుంది. సాపేక్ష ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ పిసిఆర్ చేస్తున్నప్పుడు, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ తర్వాత క్వాంటిటేటివ్ సిడిఎన్ఎ అవసరం ఉండకపోవచ్చు ఎందుకంటే ఇంటర్నల్ రిఫరెన్స్ జన్యువు సూచనగా పనిచేస్తుంది.

ఇది ప్రధానంగా జన్యువులకు సంబంధించినది, మరియు పొడవైన శకలం యొక్క రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ చాలా జన్యువులకు సాధ్యపడదు. ముందుగా, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యం PCR కంటే చాలా తక్కువగా ఉంటుంది. రెండవది, GC రిచ్ ప్రాంతం మరియు అనేక జన్యువుల ద్వితీయ నిర్మాణం రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు PCR రెండింటినీ పరిమితం చేస్తాయి. చివరగా, PCR యొక్క విశ్వసనీయత మరియు విస్తరణ సామర్థ్యం ఒకే సమయంలో హామీ ఇవ్వడం కష్టం. రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రక్రియలో, తక్కువ కాపీ జన్యువులకు, ముఖ్యంగా ఒలిగో డిటిని ఉపయోగించి పొడవైన భాగాన్ని పొందడానికి ఎవరూ హామీ ఇవ్వలేరు. మరింత GC తో 5 'UTR కొరకు, ఇది మరింత కష్టం. అందువల్ల, యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లతో ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ను రివర్స్ చేయడం, టార్గెట్ ఫ్రాగ్‌మెంట్‌లోని సహజ చీలిక సైట్‌లను కనుగొనడం, సెగ్మెంట్ల ద్వారా విస్తరించడం, ఆపై పరిమితి జీర్ణక్రియ మరియు బంధాన్ని నిర్వహించడం ఇప్పటికీ సహేతుకమైన పద్ధతి. సాధారణంగా, 2 kb కంటే పెద్ద శకలాలు నేరుగా విస్తరించడం కష్టం, కానీ దాన్ని పొందడం ఎల్లప్పుడూ అసాధ్యం కాదు: 1.మొదటిది, RNA/mRNA యొక్క సమగ్రతకు హామీ, మరియు TRIZOL వెలికితీతకు ప్రాధాన్యత ఇవ్వబడుతుంది. 2.M-MLV RT-PCR కిట్ నేరుగా ఉపయోగించవచ్చు. ఎనియలింగ్ సమయాన్ని పొడిగించండి మరియు యాంప్లిఫికేషన్ ప్రక్రియలో సైకిల్ సంఖ్యను సరిగ్గా పెంచండి. ప్రత్యామ్నాయంగా, సమూహ పిసిఆర్ వర్తించవచ్చు లేదా సాధారణ పిసిఆర్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు ముందు తగిన పొడిగించిన డీనాటరేషన్ మరియు ఎక్స్‌టెన్షన్ సమయంతో ముందుగా ఒకటి లేదా రెండు ప్రతిచర్యలు చేయవచ్చు, ఇది శకలాలు పొడిగించడానికి సహాయపడుతుంది. పాలిమరేస్ యొక్క విశ్వసనీయతకు శ్రద్ధ వహించండి. 3. ఆదర్శ ఫలితాలను పొందడానికి PCR లో లాంగ్ టాక్ ఉపయోగించవచ్చు. 4. ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ అప్లికేషన్ కోసం, అధిక విశ్వసనీయత కలిగిన పాలిమరేస్ దరఖాస్తు చేయాలి.

TIANGEN అందించే రెండు రకాల రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌లు ఉన్నాయి: క్వాంట్/కింగ్ RTase మరియు TIANScript M-MLV. వాటి మధ్య ప్రధాన వ్యత్యాసం టెంప్లేట్‌ల ఇన్‌పుట్ మొత్తం. క్వాంట్ అనేది ఒక ప్రత్యేకమైన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, ఇది మోలోనీ మురిన్ లుకేమియా వైరస్ నుంచి సాధారణంగా ఉపయోగించే M-MLV కి భిన్నంగా ఉంటుంది. క్వాంట్ అనేది ఒక కొత్త అధిక సామర్థ్యం కలిగిన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, ఇది తిరిగి ఇంజనీరింగ్ ఎస్చెరిచియా కోలి ద్వారా వ్యక్తీకరించబడింది. అధిక రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ యాక్టివిటీ మరియు అధిక దిగుబడితో 50 ng-2 μg RNA యొక్క విస్తరణకు క్వాంట్ అనుకూలంగా ఉంటుంది. సాధారణ MMLV లేదా AMV తో పోలిస్తే, క్వాంట్ యొక్క అతిపెద్ద లక్షణం ఏమిటంటే ఇది RNA టెంప్లేట్‌లతో చాలా బలమైన అనుబంధాన్ని కలిగి ఉంది మరియు అధిక ఉష్ణోగ్రత డీనాటరేషన్ లేకుండా ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ కాంప్లెక్స్ టెంప్లేట్‌లను రివర్స్ చేయగలదు. అధిక GC కంటెంట్ ఉన్న టెంప్లేట్‌ల కోసం, రివర్స్ సామర్థ్యం ఎక్కువ. అయితే, ఈ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ RNase H కార్యాచరణను కలిగి ఉంది, ఇది cDNA ఉత్పత్తి పొడవును ప్రభావితం చేయవచ్చు (<4.5 kb టెంప్లేట్‌లకు అనుకూలం). సాంప్రదాయ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కోసం, TIANScript MMLV రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ సిఫార్సు చేయబడింది. ఈ RTase అనేది చాలా బలహీనమైన RNase H కార్యాచరణతో సవరించిన ఎంజైమ్, ఇది దీర్ఘ (> 5 kb) cDNA సంశ్లేషణకు అనుకూలంగా ఉంటుంది.

సిడిఎన్ఎ సింథసిస్ మరియు యాంప్లిఫికేషన్ మధ్య ట్యూబ్ కవర్ తెరవకుండా ఒకే ట్యూబ్‌లో వన్-స్టెప్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు పిసిఆర్ యాంప్లిఫికేషన్ పూర్తవుతుంది, ఇది కాలుష్యాన్ని తగ్గించడానికి సహాయపడుతుంది. పొందిన అన్ని cDNA నమూనాలు యాంప్లిఫికేషన్ కోసం ఉపయోగించబడతాయి కాబట్టి, సున్నితత్వం ఎక్కువగా ఉంటుంది, మొత్తం RNA లో కనీసం 0.01 pg ఉంటుంది. విజయవంతమైన ఒక-దశ RTPCR కొరకు, జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లు సాధారణంగా cDNA సంశ్లేషణను ప్రారంభించడానికి ఉపయోగిస్తారు. రెండు-దశల పద్ధతి, అవి రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ మరియు PCR యాంప్లిఫికేషన్ రెండు దశల్లో నిర్వహించబడతాయి. CDNA పొందడానికి మొదట RNA టెంప్లేట్ నుండి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ నిర్వహించబడుతుంది మరియు పొందిన cDNA ఒకటి లేదా అంతకంటే ఎక్కువ విభిన్న PCR ప్రతిచర్యలకు లోబడి ఉంటుంది. రెండు-దశల పద్ధతి cDNA యొక్క మొదటి స్ట్రాండ్ యొక్క సంశ్లేషణకు మార్గనిర్దేశం చేయడానికి ఒలిగో (dT) లేదా యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించవచ్చు మరియు నిర్దిష్ట నమూనా నుండి అన్ని mRNA సమాచారాన్ని రివర్స్ చేయగలదు.