TIANSeq DirectFast లైబ్రరీ కిట్ (ఇల్యూమినా)

ప్రస్తుతం, హై-త్రూపుట్ సీక్వెన్సింగ్ టెక్నాలజీ ప్రధానంగా తదుపరి తరం సీక్వెన్సింగ్ టెక్నాలజీపై ఆధారపడి ఉంటుంది. తరువాతి తరం సీక్వెన్సింగ్ టెక్నాలజీ యొక్క పఠన పొడవు పరిమితం అయినందున, మేము పూర్తి నిడివి క్రమాన్ని చిన్న శకలాల లైబ్రరీలుగా క్రమం చేయడానికి విచ్ఛిన్నం చేయాలి. విభిన్న సీక్వెన్సింగ్ ప్రయోగాల అవసరాల ప్రకారం, మేము సాధారణంగా సింగిల్-ఎండ్ సీక్వెన్సింగ్ లేదా డబుల్-ఎండ్ సీక్వెన్సింగ్‌ను ఎంచుకుంటాము. ప్రస్తుతం తరువాతి తరం సీక్వెన్సింగ్ లైబ్రరీ యొక్క DNA శకలాలు సాధారణంగా 200-800 bp పరిధిలో పంపిణీ చేయబడతాయి.

a) DNA నాణ్యతలో తక్కువగా ఉంది మరియు నిరోధకాలను కలిగి ఉంటుంది. ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలను నిరోధించడానికి అధిక-నాణ్యత DNA నమూనాలను ఉపయోగించండి.

b) DNA లైబ్రరీని నిర్మించడానికి PCR రహిత పద్ధతిని ఉపయోగించినప్పుడు DNA నమూనా మొత్తం సరిపోదు. విచ్ఛిన్నమైన DNA యొక్క ఇన్‌పుట్ 50 ng దాటినప్పుడు, PCR- రహిత వర్క్‌ఫ్లో లైబ్రరీ నిర్మాణ ప్రక్రియలో ఎంపిక చేయబడుతుంది. లైబ్రరీ యొక్క కాపీ నంబర్ నేరుగా సీక్వెన్స్ చేయడానికి చాలా తక్కువగా ఉంటే, అడాప్టర్ లిగేషన్ తర్వాత DNA లైబ్రరీని PCR ద్వారా విస్తరించవచ్చు.

సి) RNA కాలుష్యం సరికాని ప్రారంభ DNA పరిమాణానికి దారితీస్తుంది RNA కాలుష్యం జన్యుసంబంధమైన DNA యొక్క శుద్దీకరణ ప్రక్రియలో ఉండవచ్చు, ఇది లైబ్రరీ నిర్మాణ సమయంలో సరికాని DNA పరిమాణానికి మరియు తగినంత DNA లోడింగ్‌కు దారితీయవచ్చు. RNase తో చికిత్స చేయడం ద్వారా RNA ను తొలగించవచ్చు.

A-1

a) చిన్న శకలాలు (60 bp-120 bp) కనిపిస్తాయి చిన్న శకలాలు సాధారణంగా అడాప్టర్ శకలాలు లేదా అడాప్టర్ల ద్వారా ఏర్పడే డైమర్‌లు. Agencourt AMPure XP అయస్కాంత పూసలతో శుద్ధి చేయడం వలన ఈ అడాప్టర్ శకలాలు సమర్థవంతంగా తొలగించబడతాయి మరియు సీక్వెన్సింగ్ నాణ్యతను నిర్ధారించవచ్చు.

బి) పిసిఆర్ యాంప్లిఫికేషన్ తర్వాత లైబ్రరీలో పెద్ద శకలాలు కనిపిస్తాయి, అడాప్టర్ లిగేట్ చేసిన తర్వాత లైబ్రరీ డిఎన్ఎ ఫ్రాగ్మెంట్ పరిమాణం 120 బిపి పెరుగుతుంది. అడాప్టర్ లిగేషన్ తర్వాత DNA శకలం 120 bp కంటే ఎక్కువ పెరిగితే, అది అధిక PCR యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క అసాధారణ శకలం విస్తరణ వలన సంభవించవచ్చు. PCR చక్రాల సంఖ్యను తగ్గించడం వలన పరిస్థితిని నివారించవచ్చు.

సి) అడాప్టర్ లిగేషన్ తర్వాత లైబ్రరీ DNA శకలాలు అసాధారణ పరిమాణం ఈ కిట్‌లోని అడాప్టర్ పొడవు 60 bp. శకలం యొక్క రెండు చివరలను అడాప్టర్‌లకు అనుసంధానం చేసినప్పుడు, పొడవు 120 bp మాత్రమే పెరుగుతుంది. ఈ కిట్ అందించిన అడాప్టర్‌ని ఉపయోగించినప్పుడు, అడాప్టర్ పొడవు వంటి సంబంధిత సమాచారాన్ని అందించడానికి దయచేసి సరఫరాదారుని సంప్రదించండి. దయచేసి ప్రయోగ వర్క్‌ఫ్లో మరియు ఆపరేషన్ మాన్యువల్‌లో వివరించిన దశలను అనుసరిస్తున్నాయని నిర్ధారించుకోండి.

డి) అడాప్టర్ లిగేషన్‌కు ముందు అసాధారణమైన DNA ఫ్రాగ్‌మెంట్ సైజు DNA ఫ్రాగ్మెంటేషన్ సమయంలో తప్పుడు ప్రతిచర్య పరిస్థితుల వల్ల ఈ సమస్యకు కారణం కావచ్చు. విభిన్న DNA ఇన్‌పుట్ కోసం వేర్వేరు ప్రతిచర్య సమయాలను ఉపయోగించాలి. DNA ఇన్‌పుట్ 10 ng కంటే ఎక్కువగా ఉంటే, ఆప్టిమైజేషన్ కోసం ప్రారంభ సమయంగా 12 నిమిషాల ప్రతిచర్య సమయాన్ని ఎంచుకోవాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము మరియు ఈ సమయంలో ఉత్పత్తి చేయబడిన శకలం పరిమాణం ప్రధానంగా 300-500 bp పరిధిలో ఉంటుంది. అవసరమైన పరిమాణంతో DNA శకలాలను ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి వారి స్వంత అవసరాలకు అనుగుణంగా వినియోగదారులు 2-4 నిమిషాల పాటు DNA శకలాల పొడవును పెంచవచ్చు లేదా తగ్గించవచ్చు.

A-2

ఎ) ఫ్రాగ్మెంటేషన్ సమయం ఆప్టిమైజ్ చేయబడలేదు, విచ్ఛిన్నమైన DNA చాలా చిన్నది లేదా చాలా పెద్దది అయితే, ప్రతిచర్య సమయాన్ని నిర్ణయించడానికి సూచనలో అందించిన ఫ్రాగ్మెంటేషన్ టైమ్ ఎంపిక కోసం మార్గదర్శకాలను చూడండి మరియు ఈ సమయ బిందువును నియంత్రణగా ఉపయోగించండి, అదనంగా ఏర్పాటు చేయండి ఫ్రాగ్మెంటేషన్ సమయంలో మరింత ఖచ్చితమైన సర్దుబాటు చేయడానికి రియాక్షన్ సిస్టమ్ 3 నిమిషాలు పొడిగించడం లేదా తగ్గించడం.

A-3

ఫ్రాగ్మెంటేషన్ చికిత్స తర్వాత DNA యొక్క అసాధారణ పరిమాణ పంపిణీ

ఎ) ఫ్రాగ్మెంటేషన్ రియాజెంట్ యొక్క సరికాని థావింగ్ పద్ధతి, లేదా కరిగిన తర్వాత కారకం పూర్తిగా మిశ్రమంగా ఉండదు. మంచు మీద 5 × ఫ్రాగ్మెంటేషన్ ఎంజైమ్ మిక్స్ రియాజెంట్‌ను కరిగించండి. కరిగిన తర్వాత, ట్యూబ్ దిగువ భాగాన్ని మెత్తగా విదిలించడం ద్వారా కారకాన్ని సమానంగా కలపండి. కారకాన్ని సుడిగుండం చేయవద్దు!

బి) DNA ఇన్‌పుట్ నమూనాలో EDTA లేదా ఇతర కాలుష్య కారకాలు ఉప్పు అయాన్‌ల క్షీణత మరియు DNA శుద్దీకరణ దశలో చెలాటింగ్ ఏజెంట్లు ప్రయోగం విజయవంతం కావడానికి చాలా ముఖ్యం. DNA 1 × TE లో కరిగిపోయినట్లయితే, ఫ్రాగ్మెంటేషన్ చేయడానికి సూచనలో అందించిన పద్ధతిని ఉపయోగించండి. ద్రావణంలో EDTA ఏకాగ్రత అనిశ్చితంగా ఉంటే, DNA ని శుద్ధి చేసి, తదుపరి ప్రతిచర్య కోసం డీయోనైజ్డ్ నీటిలో కరిగించాలని సిఫార్సు చేయబడింది.

సి) సరికాని ప్రారంభ డిఎన్‌ఎ పరిమాణీకరణ డిఎన్‌ఎ పరిమాణానికి డిఎన్‌ఎ ఇన్‌పుట్ మొత్తానికి దగ్గరి సంబంధం ఉంది. ఫ్రాగ్మెంటేషన్ చికిత్సకు ముందు, రియాక్షన్ సిస్టమ్‌లో DNA యొక్క ఖచ్చితమైన మొత్తాన్ని గుర్తించడానికి Qubit, Picogreen మరియు ఇతర పద్ధతులను ఉపయోగించి DNA యొక్క ఖచ్చితమైన పరిమాణాన్ని అందించడం అవసరం.

 d) ప్రతిచర్య వ్యవస్థ తయారీ సూచనలను అనుసరించదు. విచ్ఛిన్నమైన ప్రతిచర్య వ్యవస్థ తయారీ సూచనల ప్రకారం ఖచ్చితంగా మంచు మీద జరగాలి. ఉత్తమ ప్రభావాన్ని నిర్ధారించడానికి, అన్ని ప్రతిచర్య భాగాలు మంచు మీద ఉంచాలి మరియు పూర్తి శీతలీకరణ తర్వాత ప్రతిచర్య వ్యవస్థను తయారు చేయాలి. తయారీ పూర్తయిన తర్వాత, దయచేసి పూర్తిగా కలపడానికి ఫ్లిక్ చేయండి లేదా పైపెట్ చేయండి. సుడిగుండం చేయవద్దు!

1. సరికాని మిక్సింగ్ పద్ధతి (వోర్టెక్స్, హింసాత్మక డోలనం, మొదలైనవి) లైబ్రరీ శకలాలు అసాధారణంగా పంపిణీ చేయబడతాయి (కింది చిత్రంలో చూపిన విధంగా), తద్వారా లైబ్రరీ నాణ్యతను ప్రభావితం చేస్తుంది. అందువల్ల, ఫ్రాగ్మెంటేషన్ మిక్స్ రియాక్షన్ సొల్యూషన్ తయారుచేసేటప్పుడు, దయచేసి మిక్స్ చేయడానికి మెల్లగా పైపెట్ పైపెట్ చేయండి లేదా వేలిముద్రను ఫ్లిక్ చేయడానికి మరియు సమానంగా కలపడానికి ఉపయోగించండి. సుడిగుండంతో కలవకుండా జాగ్రత్త వహించండి.

2. లైబ్రరీ నిర్మాణానికి అధిక స్వచ్ఛత DNA తప్పనిసరిగా ఉపయోగించాలి

DNA మంచి DNA సమగ్రత: ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ బ్యాండ్ తోక లేకుండా 30 kb కంటే ఎక్కువ

D OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. డిఎన్‌ఎ ఇన్‌పుట్ మొత్తం ఖచ్చితంగా ఉండాలి. నానోడ్రాప్ కాకుండా డిఎన్‌ఎను లెక్కించడానికి క్యూబిట్ మరియు పికోగ్రీన్ పద్ధతులను ఉపయోగించాలని సూచించారు.

4. DNA ద్రావణంలో EDTA యొక్క కంటెంట్ తప్పనిసరిగా నిర్ణయించబడాలి EDTA ఫ్రాగ్మెంటేషన్ ప్రతిచర్యపై గొప్ప ప్రభావాన్ని చూపుతుంది. EDTA యొక్క కంటెంట్ ఎక్కువగా ఉంటే, తదుపరి పరీక్షకు ముందు DNA శుద్దీకరణ చేయవలసి ఉంటుంది.

5. ఫ్రాగ్మెంటేషన్ రియాక్షన్ సొల్యూషన్ తప్పనిసరిగా మంచు మీద తయారు చేయాలి ప్రతిచర్య సమయం యొక్క ఖచ్చితత్వాన్ని నిర్ధారించడానికి, దయచేసి మంచు మీద ప్రతిచర్య వ్యవస్థను సిద్ధం చేయండి.

6. ఫ్రాగ్మెంటేషన్ ప్రతిచర్య సమయం ఖచ్చితంగా ఉండాలి

1. ఈ కిట్‌కు ఏ రకమైన నమూనా వర్తిస్తుంది?

ఈ కిట్ యొక్క వర్తించే నమూనా రకం మొత్తం RNA లేదా మంచి RNA సమగ్రతతో శుద్ధి చేయబడిన mRNA కావచ్చు. లైబ్రరీని నిర్మించడానికి మొత్తం RNA ఉపయోగించినట్లయితే, ముందుగా rRNA ని తీసివేయడానికి rRNA క్షీణత కిట్ (Cat#4992363/4992364/4992391) ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది.

2. ఈ కిట్‌తో లైబ్రరీని నిర్మించడానికి FFPE నమూనాలను ఉపయోగించవచ్చా?

సాపేక్ష పేలవమైన సమగ్రతతో, FFPE నమూనాలలోని mRNA కొంత మేరకు అధోకరణం చెందుతుంది. లైబ్రరీ నిర్మాణం కోసం ఈ కిట్‌ను ఉపయోగించినప్పుడు, ఫ్రాగ్మెంటేషన్ సమయాన్ని ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి సిఫార్సు చేయబడింది (ఫ్రాగ్మెంటేషన్ సమయాన్ని తగ్గించండి లేదా ఫ్రాగ్మెంటేషన్ చేయవద్దు).

3. ఉత్పత్తి మాన్యువల్‌లో అందించిన పరిమాణ ఎంపిక దశను ఉపయోగించి, చొప్పించిన విభాగం స్వల్ప విచలనం కనిపించడానికి కారణం కావచ్చు?

పరిమాణ ఎంపిక ఈ ఉత్పత్తి మాన్యువల్‌లో పరిమాణ ఎంపిక దశకు అనుగుణంగా కఠినంగా నిర్వహించబడుతుంది. విచలనం ఉంటే, కారణం అయస్కాంత పూసలు గది ఉష్ణోగ్రతకి సమతుల్యం కాకపోవడం లేదా పూర్తిగా మిశ్రమంగా ఉండకపోవడం, పైపెట్ ఖచ్చితమైనది కాదు లేదా ద్రవం చిట్కాలో ఉండిపోవడం. ప్రయోగం కోసం తక్కువ శోషణతో చిట్కాలను ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది.

4. లైబ్రరీ నిర్మాణంలో ఎడాప్టర్ల ఎంపిక

లైబ్రరీ నిర్మాణ కిట్‌లో అడాప్టర్ రియాజెంట్ లేదు, మరియు ఈ కిట్‌ను TIANSeq సింగిల్-ఇండెక్స్ అడాప్టర్ (ఇల్యూమినా) (4992641/4992642/4992378) తో కలిపి ఉపయోగించాలని సిఫార్సు చేయబడింది.

5. లైబ్రరీ యొక్క QC

లైబ్రరీ క్వాంటిటేటివ్ డిటెక్షన్: లైబ్రరీ యొక్క మాస్ ఏకాగ్రత మరియు మోలార్ ఏకాగ్రతను గుర్తించడానికి క్యూబిట్ మరియు qPCR ఉపయోగించబడతాయి. ఉత్పత్తి మాన్యువల్‌కి అనుగుణంగా ఆపరేషన్ ఖచ్చితంగా ఉంటుంది. లైబ్రరీ ఏకాగ్రత సాధారణంగా NGS సీక్వెన్సింగ్ అవసరాలను తీరుస్తుంది. లైబ్రరీ పంపిణీ పరిధిని గుర్తించడం: లైబ్రరీ పంపిణీ పరిధిని గుర్తించడానికి ఎజిలెంట్ 2100 బయోఅనలైజర్‌ను ఉపయోగించడం.

6. యాంప్లిఫికేషన్ సైకిల్ నంబర్ ఎంపిక

సూచనల ప్రకారం, PCR చక్రాల సంఖ్య 6-12, మరియు నమూనా ఇన్‌పుట్ ప్రకారం అవసరమైన PCR చక్రాల సంఖ్యను ఎంచుకోవాలి. అధిక దిగుబడి గ్రంథాలయాలలో, విస్తరణ సాధారణంగా వివిధ స్థాయిలలో సంభవిస్తుంది, ఇది ఎజిలెంట్ 2100 బయోఅనలైజర్‌ను గుర్తించడంలో లక్ష్య శ్రేణి శిఖరం తర్వాత కొంచెం పెద్ద శిఖరం ద్వారా వ్యక్తమవుతుంది, లేదా క్యూబిట్ యొక్క గాఢత qPCR కంటే తక్కువగా ఉంటుంది. తేలికపాటి విస్తరణ అనేది సాధారణ దృగ్విషయం, ఇది లైబ్రరీ సీక్వెన్సింగ్ మరియు తదుపరి డేటా విశ్లేషణను ప్రభావితం చేయదు.

7. ఎజిలెంట్ 2100 బయోఅనలైజర్ యొక్క గుర్తింపు ప్రొఫైల్‌లో వచ్చే చిక్కులు

ఎజిలెంట్ 2100 బయోఅనలైజర్ డిటెక్షన్‌లో స్పైక్‌లు కనిపించడం అనేది నమూనాల అసమాన ఫ్రాగ్మెంటేషన్ కారణంగా ఉంటుంది, ఇక్కడ నిర్దిష్ట పరిమాణంలో ఎక్కువ శకలాలు ఉంటాయి మరియు ఇది PCR సుసంపన్నం తర్వాత మరింత స్పష్టమవుతుంది. ఈ సందర్భంలో, పరిమాణ ఎంపికను నిర్వహించకూడదని సూచించబడింది, అనగా ఫ్రాగ్మెంటేషన్ షరతును 94 ° C కు 15 నిమిషాలు పొదిగేలా సెట్ చేయండి, ఇక్కడ శకలం పంపిణీ చిన్నది మరియు కేంద్రీకృతమై ఉంటుంది, మరియు సజాతీయత మెరుగుపడుతుంది.